细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）包括微囊泡、凋亡囊泡和外泌体，是一类膜状囊泡，具有由内吞作用产生的磷脂双层包围结构。在纳米尺度上，EV被认为是球形的，其中含有许多生物活性成分，如脂质、蛋白质、核酸和一些代谢物。在真核生物中，EV积极参与生物过程，许多研究人员已经认识到其在病理生理功能中的作用，其中EV可作为针对某些疾病的潜在诊断和治疗剂。最近有研究表明，各种生物体液中都存在EV，包括母乳、血浆、尿液、唾液、腹水和羊水。
牛乳是婴幼儿和成人的重要营养来源，其中乳源性细胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles，MEV）是重要成分。据报道，牛乳中MEV的浓度为1×109～1×1012 个/mL。近年来，研究人员还验证了MEV在各个方面的潜在应用，包括抑制病毒复制、增强免疫和胃肠道系统功能、促进骨骼发育和促进靶向药物递送。目前，相关研究主要集中在人乳和牛乳中的MEV。尽管已经有一些研究关注驴乳和山羊乳中MEV的生物活性，但与牛乳相比，关于这些乳的MEV功能和特性的信息仍然非常有限。特别是，考虑到山羊乳在许多地区是人类营养的重要组成部分，因此仍然需要更多有关山羊乳中MEV的信息。
对MEV进行有效分离是研究MEV功能和性质的第1步。常规的分离技术包括差速离心法、免疫亲和捕获法、体积排阻色谱法、聚乙二醇沉淀法、超滤离心法等，在这些技术中，差速离心因其良好的安全性、易于实施和省时的优势而被公认为黄金标准。然而，对于一些复杂的系统，如牛乳，通过差速离心很难实现令人满意的MEV分离。其中主要的挑战是牛乳中存在丰富的蛋白质、脂质和碳水化合物，因此，在通过差速离心分离MEV之前，应先从牛乳中去除脂肪和蛋白质。此外，分离的脂质和蛋白质也可用于提取其他有价值的化合物。酸和钙螯合剂（如柠檬酸钠）通常用于沉淀或分解酪蛋白，以尽量减少牛乳蛋白的作用。尽管如此，研究发现单独使用这种方法不足以从山羊乳中分离MEV，因为山羊乳中存在较高水平的β-酪蛋白和较低水平的αS1-酪蛋白，导致酪蛋白胶束比牛乳中的酪蛋白胶束更稳定。基于这一背景，有必要开发更有效的山羊乳MEV分离方法。
陕西师范大学食品工程与营养科学学院等的付尚辰等采用柠檬酸钠螯合（sodium citrate chelation，SC）、醋酸沉淀（acetic acid precipitation，AA）和高速离心（high-speed centrifugation ，HC）3 种预处理方法结合差速离心，提高MEV分离效率。随后，比较分析了这些预处理对分离的MEV的形态、浓度、粒径和标记蛋白的影响。本研究可为山羊乳MEV的高效分离提供有用的信息，为山羊乳MEV的下游研究作出贡献。
外观上，沉淀物呈凝胶状，并随着离心力的增大而逐渐透明。MEV沉淀的形状在不同组之间存在差异；SC组和AA组MEV沉淀物的产量均低于HC组，且SC组的产量小于AA组。同样，沉淀的透明度在SC组中较高，而在HC组中较低。
结果表明，各处理组均含有酪蛋白和乳清蛋白，常规HC处理后MEV中仍残留大量的酪蛋白和乳清蛋白；SC和AA处理可有效去除羊乳中大部分酪蛋白。
图1 不同预处理方式获得山羊乳MEV 沉淀( a )和蛋白质组成( b )
SC处理产生的MEV浓度高、粒径小、纯度高。特别是在离心力为125 000×g条件下，SC处理对MEV的分离效率最高。
大写字母不同，表示相同离心力、不同预处理方式差异显著( P＜0.05)；小写字母不同，表示相同预处理方式、不同离心力差异显著( P＜0.05)。
图2 不同预处理方式获得山羊乳源MEVs 的浓度( a )、粒径( b )、RNA浓度( c )和RNA纯度( d )
结果表明，所有MEV均具有典型的膜结构。在35k组和75k组中，MEV颗粒表现出不同的大小，主要由大颗粒组成，且分布不均匀。相反，125k组的MEV粒径小、分布均匀、背景清晰。与SC组和HC组不同的是，AA组观察到的MEV呈现典型的膜结构，但有轻微的破裂，表面不平滑。
图3 不同预处理方式获得山羊乳MEV的形态
在各组MEV中均检测到3 种标志蛋白的明显信号。125k组MEV标志蛋白表达量显著高于35k组和75k组（P＜0.05），与SC-125k组和HC-125k组相比，AA-125k组的MEV显示出明显较弱的TSG101信号，而CD9和HSP70之间没有观察到显著差异。总的来说，SC-125k组的MEV可以稳定地检测到3 种标记蛋白，表明SC-125k组的MEV比其他组产生的MEV纯度更高。
( a )代表性条带；( b～ d ) HSP70、TSG101和CD9的光密度分析结果。
图4 不同预处理方式获得山羊乳MEV特异性标志蛋白的免疫印迹分析
综上，本研究证明了SC结合差速离心技术分离山羊乳MEV的潜力，有望为山羊乳MEV的进一步研究提供技术参考。
文章《Extracellular vesicles separated from goat milk by differential centrifugation coupled with sodium citrate pretreatments》发表于Food Chemistry 2024年446卷
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.138807
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